亚聚类分析（可选）

亚聚类分析

概述

亚聚类分析用于更详细地研究特定细胞群体。本教程将指导您使用 Cassia 和 Seurat 分析亚聚类群体（如 T 细胞或成纤维细胞）的过程。

前提条件

  • 包含单细胞数据的 Seurat 对象
  • 已安装并加载 Cassia 包
  • 对 R 和单细胞分析有基本了解

工作流程概要

  1. 初始 Cassia 分析
  2. 亚聚类提取和处理
  3. 标记物识别
  4. Cassia 亚聚类分析
  5. 不确定性评估（可选）

详细步骤

1. 初始分析

首先，在完整数据集上运行默认 Cassia 流程以识别主要细胞群体。

2. 亚聚类处理

使用 Seurat 提取和处理目标聚类：

# 提取目标群体（以 CD8+ T 细胞为例）
cd8_cells <- subset(large, cell_ontology_class == "cd8-positive, alpha-beta t cell")
 
# 数据标准化
cd8_cells <- NormalizeData(cd8_cells)
 
# 识别可变特征
cd8_cells <- FindVariableFeatures(cd8_cells, 
    selection.method = "vst", 
    nfeatures = 2000)
 
# 数据缩放
all.genes <- rownames(cd8_cells)
cd8_cells <- ScaleData(cd8_cells, features = all.genes)
 
# 运行 PCA
cd8_cells <- RunPCA(cd8_cells, 
    features = VariableFeatures(object = cd8_cells),
    npcs = 30)
 
# 执行聚类
cd8_cells <- FindNeighbors(cd8_cells, dims = 1:20)
cd8_cells <- FindClusters(cd8_cells, resolution = 0.3)
 
# 生成 UMAP 可视化
cd8_cells <- RunUMAP(cd8_cells, dims = 1:20)

3. 标记物识别

识别每个亚聚类的标记物：

# 查找标记物
cd8_markers <- FindAllMarkers(cd8_cells,
    only.pos = TRUE,
    min.pct = 0.1,
    logfc.threshold = 0.25)
 
# 筛选显著标记物
cd8_markers <- cd8_markers %>% filter(p_val_adj < 0.05)
 
# 保存结果
write.csv(cd8_markers, "cd8_subcluster_markers.csv")

4. Cassia 亚聚类分析

对亚聚类运行 Cassia 分析：

# 基本分析
runCASSIA_subclusters(
    marker = marker_sub,
    major_cluster_info = "cd8 t cell",
    output_name = "subclustering_results",
    model = "anthropic/claude-3.5-sonnet",
    provider = "openrouter"
)
 
# 对于混合群体
runCASSIA_subclusters(
    marker = marker_sub,
    major_cluster_info = "cd8 t cell mixed with other celltypes",
    output_name = "subclustering_results2",
    model = "anthropic/claude-3.5-sonnet",
    provider = "openrouter"
)

5. 不确定性量化评估（可选）

为获得更可靠的结果，计算 CS 分数：

# 运行多次迭代
runCASSIA_n_subcluster(
    n = 5,
    marker = marker_sub,
    major_cluster_info = "cd8 t cell",
    output_name = "subclustering_results_n",
    model = "anthropic/claude-3.5-sonnet",
    temperature = 0,
    provider = "openrouter",
    max_workers = 5,
    n_genes = 50L
)
 
# 计算相似性分数
similarity_scores <- runCASSIA_similarity_score_batch(
    marker = marker_sub,
    file_pattern = "subclustering_results_n_*.csv",
    output_name = "subclustering_uncertainty",
    max_workers = 6,
    model = "claude-3-5-sonnet-20241022",
    provider = "anthropic",
    main_weight = 0.5,
    sub_weight = 0.5
)

技巧和建议

  • 在亚聚类之前，始终先运行默认的 Cassia 分析
  • 根据数据的复杂性调整聚类分辨率
  • 处理混合群体时，在 major_cluster_info 参数中指定这一点
  • 使用不确定性评估获得更稳健的结果

输出文件

该分析生成几个输出文件：

  • cd8_subcluster_markers.csv：每个亚聚类的标记基因
  • subclustering_results.csv：基本 Cassia 分析结果
  • subclustering_uncertainty.csv：相似性分数（如果执行不确定性评估）
比较细胞类型（可选）额外注释增强（可选）